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    公开号:WO1991009969A1
    申请号:PCT/JP1990/001725
    申请日:1990-12-27
    公开日:1991-07-11
    发明作者:Koji Suzuki；Ekuko Uchijima；Shuji Kodama；Misako Nagai；Kyoko Mikawatani
    申请人:Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 新規な抗ヒ 卜 ト ロ ンボモジュ リ ンモ ノ ク ローナル抗体および酵素免疫測定法 によ る.血管内皮障害の診断方法
    [0003] [技術分野 ] '
    [0004] 本発明は、 抗ヒ 卜 ト ロ ンボモジュ リ ンモ ノ ク ローナル' 抗体に関する ものであ り 、 さ らに、 そのモノ ク ローナル 抗体を用いた酵素免疫学的.測定方法によ り 、 血中に存在 する ヒ 卜 ト ロンボモジュ リ ンお よびその分解産物を定量 し、 それによ つて 、 血管内皮障害を診断する方法に関す る ものである 。
    [0005] [背景技術 ]
    [0006] 血管内皮細胞は、 血管内腔を一層で覆い、 血液と直接 に接 して いる細胞であ り 、 極めて多 く の生理活性物質を 産生 し、 抗血栓性、 物質の選択的透過性、 血管緊張の維 持などを司って いる ものである 。 近年、 血管内皮に障害 が加わる と 、 生体の恒常性が失われ、 種 々の病的状態が 生ずる こ と が明らかにされて き て いる （長沢俊彦、 第 85 回 日本医学会シンポジゥム予稿集、 2 ( 1 989 ) ) 。
    [0007] 動脈硬化の発症は、 血管内皮の障害に端を発する と 言 われて いる 。 この動脈硬化に基づく 脳や心臓の虚血性疾 患は、 欧米における死因の上位を 占.めてお り 、 わが国で も増加の一途をた どって いる 。 また、 糖尿病性腎症、 糖 尿病性網膜症と いった血管障害に基づく 糖尿病の合併症 は、 糖尿病患者の余命を左右する大き な因子である と考 え られている 。 さ らに、 全身性エ リ テマ トーデス （ S L E ) 慢性関節リ ウマチ、 強皮症などの種々の膝原病は、 その 原因が未だ明らかにされていないが、 それらについては いずれも 自己免疫現象な どの免疫異常の関与が示唆され てお り 、 また、 炎症の場が血管結合組織である こ とから 血管障害を呈する ものである こ と が知られて いる 。
    [0008] 従来、 各種の膠原病を診断する手段のひとつと して リ ゥマ トイ ド因子および抗核抗体の存在、 ならびに血清補 体価の増減などの免疫異常の有無を調べる方法があるが 膠原病における血管障害の程度を示すパラメータ一は、 現在までのと ころ報告されていない。
    [0009] - その他、 溶血性尿毒症性症候群、 妊娠腎、 川崎病、 腎 移植の拒絶反応制御にシク ロスポリ ンを大量使用 した と き の腎機能障害など、 病態形成に血管内皮障害が関与 し ている と考え られる疾患は極めて多い。
    [0010] そこで、 血管内皮障害の程度を 、 簡便かつ定量的に検 出する方法が見出されれば、 その方法は、 血管内皮障害 が関与 している と考え られている疾患の発症因子、 病態 形成の機序、 予防法、 治療法の探索などに重要な役割を 果たすと考え られる 。
    [0011] 血管は、 血液と直接に接して いる血管内皮細胞と それ らを被う 筋線維や結合組織から成ってお り 、 上記のこ と を解決するために、 血管障害に起因する血液に流出 した 血管内皮細胞由来成分の測定が、 有効と考え られる 。 し か し、 血管内皮障害は、 従来の凝固系の血液検査では、 検出する こ と が不可能であ り 、 また、 近年、 血管内皮細 胞の培養系を用い、 障害モデルを作成する研究や、 血管 内皮由来の様々 な物質に関する研究が進展 し、 注目 され て いるが、 血管内皮障害の程度を的確に判断するための 方法は、 まだ確立 れて いない。
    [0012] 血管内皮由来の物質の中で、 最近特に注目 されて い ¾ 物質と して 、 ト ロンボモジュ リ ンがあげられる 。
    [0013] 血管内皮細胞膜タ ンパク質である ヒ 卜 卜 ロンボモジュ リ ンは、 分子量約 78， 000ダル ト ンの 1 本鎖糖タ ンパク質 で、 c D N A構造に基づく と 成熟タ ンパク質は 55 7 ア ミ ノ酸 から成 り 、 合成直後の未熟タ ンパク 質には 1 8ア ミ ノ酸か ら成る シグナルペプチ ドが存在する 。 成熟タ ンパク質は、 N H 2 末端厠を細胞外に、 C 00 H末端厠を細胞質に向けて配 列され、 細胞外領域には N H 2 末端 ドメ イ ン、 連続的な 6 個の成長因子様構造から成 り 卜 ロ ンビンの結合する部位 である上皮成長因子 （ E G F )様 ドメ イ ン、 さ らに、 糖鎖結 合 ドメ イ ンが存在する 。 ト ロンボモジュ リ ンは、 ト ロン ビンと 1 ： 1 で結合 し、 ト ロ ンビンによ るプロティ ン C の活性化を 2， 000 倍程度高める コ フ ァ ク タ一 と して機能 し、 プロテイ ン C凝固制御系に関与 して いる 。 また 卜 口 ンボモジュ リ ンは、 ト ロンビンの向凝固作用 （ フ イ ブ リ ノーゲン凝固活性、 血小板活性化、 V因芋活性化など ） を阻害する 。 従って 、 卜 ロ ンボモ ジュ リ ンは、 ト ロ ンビ ンの機能を向凝固から抗凝固へと 転換する血管内皮上の 重要な凝固制御因子であ り 、 脳以外のほと んど全ての組 織の動脈、 静脈、 毛細血管、 リ ンパ管の内腔や胎盤の合 胞体栄養細胞表面に存在し、 体液の凝固阻止に深く 関与 して いる と考え られている 。
    [0014] ト ロ ンボモジュ リ ンは、 血中や尿中にも存在する ； と が明らかにされている （ Ish i i H. and Majerus P. W. , J. C I in. Invest. , 76, 2178- 2181 ( 1985 ) ) 。 血中に存在 する 卜ロンポ、モ ジュ リ ンとは、 分子量の不均一な血液溶 解性のタ ンパク 質であ り 、 その由来は、 血管内皮細胞か らの分泌反応によ って遊離した ものではなく 、 血管內皮 細胞の破壊の過程でプロテアーゼによって分解され、 血 中に遊離したもの と考え られている 。 従って 、 血中に存 在する これらの ト ロ ンボモジュ リ ンおよびその分解産物 (以下、 血中 ト ロ ンボモジュ リ ンと 略記する ） を定量で きれば、 その定量値は、 血管内皮障害の程度を示す指標 と な り 得る こ と から 、 感度、 精度および簡便性に優れた 測定法の開発が、 強く 望まれて いる 。
    [0015] 血中 ト ロ ンボモジュ リ ンを定量する方法と しては、 従 来、 抗 ト ロ ンボモ ジユ リ ンポ リ ク ローナル抗体を用い る ラ ジオィ ムノア ッセィ （ Ishi i H. and Majerus P. W. , J. C t i n. Invest. , 76 , 2178 - 218 ( 1985 ) ) 、 抗 ト ロ ン ボモ ジュ リ ンモ ノ ク ローナル抗体を用いるェ ンザィ ム ィ ム ノ ア ッ セィ （ 石井 ら 、 臨床病理、 、 266 - 271 ( 989 ) 、 K i m u r a S. et aに J. B iochein. , 1_05 , 478 - 483 ( 1989 ) ) な どが報告されて いるが、 測定系によ って 絶対値が異なってお り 、 また、 いずれの測定系において も各測定値を疾患群別に分けた場合、 バラ ツキが大き く 、 血管内皮障害の程度を如実に反映 して いる と はいえない。
    [0016] [発明の開示 ]
    [0017] ラジオィ ム ノア ッセィ ゃェンザィ ムィ ムノア ツセィ の 5 よ う な免疫学的測定法においては、 用いる抗体の特異性、 結合部位、 安定性な どによ って 、 その感度や精度が左右される 。 特に血中 ト ロ ンボモジュ リ ンは、 分子量的に均 一なタ ンパク質でないので、 安定 したデータ を得るため には、 適切な抗体の作成が非常に重要である 。 そ こで本 ' 0 発明者は、 この点を踏ま えて種々検討 した結果、 ヒ 卜 ト ロンボモジュ リ ンの生理活性に影響を及ぼす抗ヒ 卜 ト ロ ンボモジュ リ ンモノ ク ローナル抗体中、 卜 ロンビンによ るプロティ ン Cの活性化を促進する ト ロ ンボモジュ リ ン の作用を阻害する作用 （ 以下、 プロテイ ン c活性化阻害
    [0018] ' 5 作用 と い う ） を持つ抗ヒ トモ ノ ク ローナル抗体を用いて 、 酵素免疫測定を行 う こ と によ り 、 血中 卜 ロ ンボモジユ リ ンの う ち、 前記モノ ク ローナル抗体と結合する物質を定 量 し、 その定量値を健常人血中の定量値と 比較する こ と に基づいて 、 血管内皮障害を 、 迅速で、 簡便かつ定量的 · に診断する方法を提供する こ と に成功した。
    [0019] 特に、 前記の方法に用いるモ ノ ク ローナル抗体と して 、 卜 ロンビンの ト ロンボモジュ リ ンに対する結合を阻害す る作用 （ 以下、 卜 ロンビン結合阻害作用 と い う ） を持つ モノ ク ローナル抗体と 、 ト ロンビン結合阻害作用は持た5 ないが、 プロテイ ン C话性化阻害作用を持つ抗ヒ トモ ノ ク ロ一ナル抗体の二種類のモ ノ ク ローナル抗体を使用 し て 、 サン ドィ ツチ法に基づく 酵素免疫測定を行った場合、 血管内皮障害診断方法と して 、 精度および感度に優れ、 また、 患者血中の定量値を経時的に測定する こ と によ り 、 病態の経過観察に有用である こ と が見出された。
    [0020] すなわち、 本発明は、 ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ンの生理 . 活性に影響を及ぼす抗ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ンモノ ク ロ . ーナル抗体で、 特に、 プロテイ ン C活性化阻害作用を持 っ抗ヒ ト ト ロンボモジュ リ ンモノ ク ローナル抗体を提供 する ものであ り 、 さ らに.、 そのモノ ク ローナル抗体の う ち、 卜ロ ンビン結合阻害作用を有するモノ ク ローナル抗 体を提供する ものである 。 さ らに.、 本発明は、 プロティ ン c活性化阻害作用を持つ抗ヒ 卜 卜 ロ ンボモジュ リ ンモ ノ ク π—ナ /レ抗体を用いて 、 酵素免疫測定を行う こ と に よ り 、 血中 ト ロンボモジュ リ ンの う ち、 前記のモノ ク ロ ーナル抗体と結合する物質を定量し、 その定量値を 、 健 常人血中の定量値と 比較する こ と に基づいて 、 血管内皮 障害を診断する方法を提供する ものであ り 、 さ らに、 前 記の方法に用いるモノ ク ローナル抗体と して 、 二種類の モノ ク ローナル抗体を使用 し、 その一種類が、 ト ロ ンビ ン結合阻害作用を持つ抗ヒ 卜 ト ロ ンボモジュ リ ンモ ノ ク ローナル抗体であ り 、 他の一種類が、 小 ロ ンビン結合阻 害作用は持たないが、 プロテイ ン C活性化阻害作用を持 っ抗ヒ ト 卜 ロンボモジュ リ ンモノ ク ローナル抗体である 血管内皮障害を診断する方法を 、 提供する ものである 。 以下に本発明の実施例をあげ、 本発明を さ らに詳細に 説明する 。 尚、 本実施例はひとつの例示であって 、 例え ば、 酵素免疫測定法と しては、 第一抗体固相法、 二抗体 法、 エ ミ ッ 卜法.（ Enzyme mu 11 i p I i ed immunoassay te- c h n i q u e ； FMIT ) 、 ェンザィ ムチャ ンネ リ ングイ ムノア. ッセィ 法、 酵素活性修飾物質標識ィ ムノア ッセィ 法およ び リ ボゾーム膜一酵素ィ ムノア ッセィ 法な どの競合法や、 サン ドイ ッチ法、 ィ ムノェ.ンザィ ムメ ト リ ッ クア ツセィ 法、 酵素活性増強ィ ム ノア ッセィ 法およびプロキシマー ル リ ンケージィ ムノ ア ッセィ 法などの非競合法などがあ り 、 これらの方法は、 適宜、 任意に選択 し、 使用する こ と ができ る 。
    [0021] さ らに、 上記の測定法においては、 固相担体と して 、 · 抗原や抗体を受動的に良 く 吸着するポリ スチレン製、 ポ リ カーボネィ ト製、 ポ リ プロ ピレ ン製、 あるいはポ リ ビ ニール製のボール、 マイ ク ロフ。レー ト 、 ステ ィ ッ ク 、 試 験管な どの種々 の材料および使甩形態を、 適宜、 使用す る こ と ができ る 。
    [0022] また、 標識用酵素と しては、 ペル才キシダーゼ、 アル カ リ フ ォ スフ ァ ターゼある いは ー D—ガラ ク 卜 シダー ゼな どがあ り 、 また、 それらの酵素活性の測定方法と し ては、 比色法、 螢光法、 生物発光法あるいは化学発光法 などがあ り 、 これらの酵素および酵素活性測定法を 、 適 宜組み合わせて用いる こ と ができ る：。 一方、 酵素標識を 付与する抗体と しては、 抗体含有物を硫安分画した後、 DEAE—セ フ ァセルのごと き陰ィ オン交換ゲルによ り精製 した IgG分画、 さ らには、 ペプシン消化後、 還元 して得 られる特異的結合部分 Fab'を用いる こ と もでき る 。
    [0023] また、 測定対象試料と しては、 血清、 血漿など、 いず れも使用する こ と ができ る 。
    [0024] 実施例 1
    [0025] 抗ヒ ト ト ロ ンボモジユ リ ンモノ ク ローナル抗体の作製 - (a) 抗原一ヒ ト 卜ロンボモジュ リ ンの調製
    [0026] t ト胎盤を材料と して 、 J. Bioに Chei , 259, 12246 - 12251 ( 1984〉 に記載の Salem らの方法に従って 、 界面 活性剤を用いて ヒ ト ト ロンボモジュ リ ンを抽出および可 溶化した。
    [0027] 次に、 B i oc i rn. B i ophys. Acta , 882 , 343 - 352 ( 986 ) に記載の Su k iらのゥシ肺から トロンボモジュ リ ンを精 製する方法と 同様に、 ァフ ィ 二テ ィ ーク 口マ トグラ フ ィ 一およびゲルろ過法を用いて 、 この ト ロ ンボモジュ リ ン を含有する溶液から ト ロンボモジュ リ ンを精製した。 す なわち、 ジイ ソプロ-ピルフルォロ リ ン酸によ り不活化し た トロンビンをァガロースに固相化 した DIP— ト ロンビ ンーァガロースを用いてァフ ィ ニテ ィ ーク ロマ 卜グラ フ ィ ーを 2 回行った後、 ウル ト ロゲル AcA 44力 ラム （ LKB) を用いたゲルろ過を行い単離、 精製した。
    [0028] 精製したヒ ト ト ロンボモジユ リ ンは、 J . C e Iし B i 0 I · , 17 , 835 - 851 ( 1975 ) に記載の Blobel l Dobb&rste- inの方法に従い、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム—ポリ アク リ o
    [0029] ルア ミ ド ゲル電気泳動法 （ SDS-PAGE) を用いて調べた と ころ 、 非還元状態では、 分子量約 78, 000ダル ト ンの 1 本 のバン ドを示 し、 還元状態では、 105， 000 ダル ト ンの単 一なバン ドを示 した。
    [0030] (b) .抗体産生細胞の調製
    [0031] 6週令の Ba I b/c雌マウス 2匹を まずフロイ ン ド完全ァ ジュバン ド中で、 前記（ a ) で精製したヒ ト ト ロンボモジ ュ リ ンで初回免疫 した。 すなわち、 それぞれのマウスに Qju gのヒ ト 卜 ロンボモジュ リ ンを 0.5 m の溶液と して 腹腔内投与 した。 その後、 15日 目 に 62.5Π1Μ塩化ナ ト リ ゥムおよび 0 , 031 %ルブロール含有 12 · 5 m M ト リ ス一塩 酸緩衝液 （ PH 7.5 ) に溶解 した 50 gのヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ンを追加免疫 した。 さ らに、 最終免疫と して 、 49 日 目 に 、 腹腔内投与 （ 50 § Ζ 450 ζ ； 100ΙΒΜ塩化ナ5 ト リ ウムおよび 0.05%ルブロール含有 20UM ト リ ス 一塩 酸緩衝液， ΡΗ 7 · 5に溶解 ） によ り補助免疫 し、 3 日後に マウス脾臓を取 り 出 し、 脾細胞を調製した。
    [0032] (C) 細胞融合 . . '
    [0033] (1) 以下の材料および方法を用いた。
    [0034] 0 RPMI 1640 培地 = RPHI o.1640 ( F i ow Lab. , Inc. )に、 重炭酸ナ ト リ ウム （24πιΜ' ) 、 ピルビン酸ナ ト リ ウム ( 1mM ) 、 ペニシ リ ン Gカ リ ケム （ 50 Uノ miM 、 硫酸 ス ト レプ ト マイ シン （ 50 g Z ) および硫酸ア ミ 力 シン （ 100 g ) を 加 え 、 ド ラ イ ア イ ス で ΡΗを
    [0035] 7.2 に調整し、 0.2 // m 東洋メ ンブレンフ ィ ルターで 除菌ろ過 した 。
    [0036] NS— 1 培地 ： 上記 RPMI 1640 培地に除菌ろ過した仔牛 胎児血清 （ M. LBioproducts)を 、 15% ( v/v)の濃度に 加えた。 · . PEG 4,000 溶液 ： R P M ΐ 1640 培地のポリエチレングリ コ ー ノレ 4, 000 (PEG 4,000、 Merck S Co. , Inc. )50% ( w/w)無血清溶液を調製した。
    [0037] 8—ァザグァニン耐性 ミエローマ細胞 MS— 1 ( P3- NS1 - 1 》 と の 合は 、 Selected Method in Cel lular Inimuno I ogy ( ed. B, B. H i she I i and S.M.Shi igiつ、 W. H. Freeman and Company ( 980 ) 、 351— 372に記載の (Hらの方法を若干改変して行った。
    [0038] (2) 前記（b) で調製した有核脾細胞 （生細胞率 100 % ) と ミエローマ細胞 （生細胞率 100 % ) と を 5 ： 1 の割 合で融合 した。 脾臓細胞と ミエローマ細胞と を別に前 記の RPMi 1640 培地で洗浄した。 次に同 じ培地に懸濁 し、 融合させるため'上記の割合で混合した。 容量 50ffi2 の円錐形ス チ ロール樹脂製試験管 （ Iwaki Glass)を用 いて 、 40ffl の RPMI 1640 培地中、 400 X g 、 10分間遠 心分離し、 上清を完全に吸出 した 沈殿細胞に、 37eC 加温 PEG 4,000 溶液 2.1IRJ1 を穏やかに撹袢しながら 1 分間で滴下し、 さ らに 1 分間撹拌し、 細胞を再懸濁、 分散させる 。 次に、 37で加温 RPHI 1640培地 2.Ίπιϋ を 1分間で滴下した。 この操作を さ らに 1 回繰 り返した 後、 同培地 14.7 ^を 2〜 3分間で常に撹拌 しながら滴 下 し、 細胞を分散させた。 これを 400X g 、 10分間遠 心分離 し、 上清を完全に吸引除去 した。
    [0039] 次にこの沈殿細胞に、 37で加温 ^— 1 培地 21012をす みやかに加え 、 細胞の大き い塊を 、 10 miのピペ ッ ト を 用いて注意深く ピべ ッテ ィ ング して分散 した。 さ らに 同培地 42ΙΒΓを加えて希釈 し、 ポ リ スチレ ン製 96穴マイ . ク ロウエル （ Iwak i Glass)に、 1 ゥエル当た り 、 6 0 X 105 個/ / (K lmJl の細胞を加えた。 なお、 この時使用 した 96穴マイ ク ロウェルは、 前処理と して 0· 2πιϋ の NS — 1 培地を加え 、 炭酸ガス培養器中 （ 37で ） で一晩保 温 し、 使用時に培地を吸引除去 した。 細胞を加えた上 記のマイ ク ロウェルを 7 %炭酸ガス / 93%空気中で温 度 37 、 湿度 100 %下に培養に付 した。
    [0040] (d) 選択培地によ るハイ プ リ ドーマの選択的増殖
    [0041] ( 1 ) 使用 した培地は下記の と お り である 。
    [0042] HAT 培地 ： 前記（C) で述べた NS— 1 培地に さ らにヒポ キサンチン い 00 z M ) 、 ァモノプテ リ ン （0.4 M ) お よびチ ミ ジン （ 16 M ) を加えた。
    [0043] HT培地 ： ア ミ ノ プテンを除去 した以外は、 上記 HAT 培 地と 同一組成のものである 。
    [0044] (2) 前記（ c ) の培養開始後翌日 （ 1 日 目 ） 、 細胞にパ スツールピペ ッ トで HAT培地 2滴 （約 0.1πιϋ ) を加え た， 2 、 3 、 5 、 8 、 11日 目に培地の半分 （ 0 · .1 Π) J! ) を新 しい HAT培地で置き換え 、 14日 目に培地の半分を 新 しい HT培地で置き換えた。 以降 3 〜 4 日毎に培地の 半分を新 しい HT培地で置き換えた。 通常 2 〜 3週間で 充分.なハイ プリ ドーマの生育が観察される 。 ハイ プリ ドーマ生育ゥエルについて 、 次項（e) に記載の固相一 抗体結合テス ト （ E LISA)法によ り 陽性ゥエルをチエ ツ ク した。 次にフ ィ ーダ一 と して 107 個のマウス胸腺細 胞を含む HT培地 1 n2を ポ リ ス チ レ ン製 24セルゥエル ( Iwaki G lass)に加えた ものを用い、 上記で検出され . た各陽性ハイ プリ ドーマの全内容物を移した。 これを 、 前記 (C) における と 同様に 7 %炭酸ガス存在下、 37 C で約 1 週間培養に付し.た。 その間 1 〜 2 回、 各ゥエル の上清 0.5IBJ2 を新しい HT培地 0.5mil と交換した。 ハイ ブ リ ドーマの充分生育した時点で ELISA 法によ り 陽性 を再確認 し、 それぞれについて 、 後記け） 項に記載の 限界希釈法による ク ローニングを行った。 なお、 ク ロ 一二ングに使用後の残液を 、 ポ リ スチレ ン製 25cm 2 組 織培養フラ スコ （ Iwaki Glass)に移 し、 凍結保存用試 料を調製 した。
    [0045] (e) 固相一抗体結合テス ト （ ELISA)によ る抗ヒ 卜 ト ロン ボモジュ リ ン抗体産生ハイ プリ ドーマの検索
    [0046] Anal . Bioc em. 104, 205 - 214 ( 1980 ) に記載の Re- nnard らの方法を若干改変 した方法を用いた。 この方法 は、 ハイ ブ リ ドーマ抗体の検出に適 して いる 。 96穴 ミ ク ロ タ イ ト レーシ ヨ ンプレー 卜 ( F low Lab.， Inc. ) を 50 n gのヒ ト 卜 ロンボモジュ リ ンでコー ト し、 次に、 未 コー ト部分を 1 %牛血清アルブ ミ ン （ BSA)でブロ ッ ク し た。 これに前記（ d ) で得られ.たハイ プ リ ドーマ生育ゥェ ルの上清の一部を加えて室温で約 1 時間ィ ンキ ュベー 卜 した。 2次抗体と して西洋わさびペルォキ シダーゼ標識 ャギ抗マウス シムノグロブ リ ン （ Ca p pe I La b■ )を加え、 さ らに室温で約 1 時間イ ンキ ュベー ト した。 次に基質で.. ある過酸化水素と o — フ エ二レ ンジア ミ ンを加え、 生成 した褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、 ある いは マイ ク ロアレー ト リ ーダー .（ MPR-A4、 東ソー株式会社） を用いて 492 nmの吸光度を測定した。
    [0047] (f ) ク ローニング
    [0048] 前記（ d ) の操作後、 各ゥエル中にほ 2種以上のハイ ブ リ ドーマが生育 して いる可能性があるので、 限界希釈法 によ り ク ローニングを行い、 モ ノ ク ローナル抗体産生ノ、 イ ブ リ ドーマを取得 した 。 N S— 1 培地 1 当た り フ ィ ー ダ一 と して 107 個のマウス胸腺細胞を含むク ローニング 培地を調製 し 、 96穴マイ ク ロウェルの 36ゥエル、 36ゥェ ルおよび 24ゥエルにゥエル当た り 5個、 1 個および 0.5 個のハイ プ リ ドーマを加えた。 5 日 目 、 12日 目に全ゥェ ルに各々約 0.1πι.β の NS— 1 培地を追加 した。 ク ローニン グ開始後 14〜 15日で充分なハイ プ リ ドーマの生育が認め られ、 コロニー形成陰性ゥエルが 50%以上である群につ いて ELISA を行った。 テス ト した全ゥェルが陽性でない 場合、 抗体陽性ゥエル中のコ ロニー数を確認し 、 ゥエル 中に 1 コ ロニーが確認されたゥエルを 4 〜 6個選び再ク ローニング した。 最終的にヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ンに対 するモノ ク ローナル抗体産生ハイ ブ リ ド一マ 6株が得ら れた。
    [0049] (g) モノ ク ローナル抗体の生体外増殖および生体内増殖 モノ ク ローナル抗体の増殖は、 常法に従った。 すなわ ち、 得られた各ハイ プリ ドーマを NS— 1 培地などの適-当 な培養液で培養 （生体外増殖） し、 その培養上清から 10 〜 100 u g Z miの濃度のモノ ク ローナル抗体を得る こ と' ができ た。 一方、 大量に抗体を得るために、 脾細胞と ミ エローマ細胞の由来動物と 同系の動物 （ Balb/cマウス ） に、 1 匹当た り 0.5 の腫瘍形成促進剤プリ ス タ ン （ 2, 6, 10, 14 ーテ 卜 ラメ チルペンタ デカ ン、 Aldrich Chemical )を腹腔内投与 した。 1〜 3週間後に、 各ハイ プ リ ド 一マ 1 X 107 個を同 じ く 腹腔内投与 し、 さ らにその 1〜 2週間後に生体内で産生された 4〜 7 t¾Z miiのモ ノ ク ロ —ナル抗体を含む腹水を得る こ と ができた。
    [0050] (h) モノ ク ローナル抗体のアイ ソ タ イ プ
    [0051] 前述した ELISA 法に従って 、 ヒ ト ト ロンボモジュ リ ン を コー ト した ミ ク ロタイ 卜 レーシ ョ ンプレー トに前記（g ) で得られた各々 の腹水を加えた。 0.15 M塩化ナ ト リ ウム 含有リ ン酸緩衝液 （ PH 7.1 ) (PBS ) によ り洗浄した後、 ア イ ソ タ イ プ特異的ゥサギ抗マウス IgG抗体 （ Zynted Lab. Inc. ) を加えた。 PBS によ る洗浄後、 西洋わさびべ ルォキシダーゼ摸識ャギ抗ゥサギ I g G ( H +い抗体を加え、 基質と して 、 過酸化水素および 2, 2'—アジノ ージ （ 3 — ェチルベンゾチアゾリ ン硫酸）， を用いて検出 した。 その 結果を ま とめて後掲の第 1 表に示 した。 得られた抗ヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ンモノ ク ローナル抗体の う ち、 5個が 免疫グロブ リ ン鎖 r 1 / を 、 また、 1 個.がァ 2a_ を有 して いた。
    [0052] ( i ) モノ ク ローナル抗体の精製
    [0053] 前記（ g ) で得られた各腹水を 、 ァフ ィ ゲルプロテイ ン—
    [0054] A MAPS- Π キ ッ ト （ B i o— Rad ) を用いて精製した。
    [0055] ( j ) ヒ ト ト ロンボモ ジュ リ ンに対するモノ ク ローナル抗 体の親和定数
    [0056] 前記（ i ) で得られた各モノ ク ローナル抗体のヒ 卜 卜 口 ンボモジュ リ ンに対する親和定数を、 5niM CaC^存在下 において 、 ELISA 法を用いて求めた。 すなわち、 先述の ELISA 法に従っ て 、 ミ ク ロタイ ト レーシ ヨ ンプレー ト に ヒ ト 卜 ロンボモ ジユ リ ンを コ一 卜 し、 1 % BSA でブロ ッ ク した。 次に、 前記（ i ) で得られた各モ ノ ク ローナル抗 体を 、 5niM CaC^含有の緩衝液に溶解し、 SOOn g Z m!Jに 調製 した ものを段階希轵 し、 その各々 100 u J! を前記で 調製した ミ ク ロタ イ ト レーシ ヨ ンプレー トの各ウエノレに 添加し、 室温で約 1 時間イ ンキ ュベー ト した。 以下、 二 次抗体反応と 発色反応を 、 前記 ） C ELISA 法に従って 行い、 得られた測定値から常法に従って親和定数 （ Kd ) を求めた。 その結果を、 第 2表に示した。
    [0057] 実施例 2
    [0058] 血中 卜 ロ ンボモジュ リ ンの定量に用いる抗体の選択
    [0059] (a) プロテイ ン C活性化阻害作用の検討 . ト ロ ンボモジュ リ ン溶液と 、 抗体溶液を混和 した溶液 を、 各々調製し、 これらを 、 プロテイ ン C活性測定に用 いる こ と によ り 、 ト ロンボモジュリ ンのプロテイ ン C活 性化促進作用.に対する各モ ノ ク ローナル抗体の影響を検 討した。 .
    [0060] すなわち、 J. Bio l . Cheni. , ^ϋ, 2206- 2212 , ( 1987 ) に記載の Kurosawaらの方法に従って 、 エラスターゼ処理 によ って 、 分子量 50, 000の ト ロンボモジュ リ ン フ ラグ メ ン ト （エラスターゼ フラグメ ン ト ） を調製 した。 こ のエラスターゼ フラグメ ン トは、 ト ロンボモジュ リ ン のプロテイ ン C活性化促進作用を有 し、 水に可溶性であ る 。 このエラスターゼ フラグメ ン ト を 、 0.1 M リ ン酸 緩衝液 （ PH 7.5 ) に溶解した （ 500n g ) 。 このエラ スターゼ フ ラグメ ン ト溶液と 、 実施例 1 ( j ) で調製 し た各モノ ク ローナル抗体の緩衝溶液 （ C！ 〜
    [0061] を用いて 、 卜 ロ ンボモジュ リ ンに対する抗体のモル比が、 0 , 1/4 , 1/2 , 1/1 ., 2/1 および 4/1 と なる よ う に、 それぞれに混合液を調製した。 この混合溶液を 10^ずつ 用いて 、 臨床病理， 6 (特集） , 63, ( 1985 ) に記載の 鈴木らの方法に従って 、 プロテイ ン C活性測定を行った。 その結果、 I9G ( ク ロー ン 21-3H1 ) 、 IgG ( ク ローン 21 -4G3 ) 、 IgG ( クローン 2卜 6F7 ) および IgG ( ク ローン 21 - 9H 12 )が、 ト ロンボモジュ リ ンのプロティ ン C.活性化 促進作用を 、 低下させる こ と が分かった （第 3表 ） 。
    [0062] (b) ト ロ ン ビ ン結合阻害作用の検討 固相ィ匕 した ト ロ ンボモ ジュ リ ン フ ラグメ ン ト を抗体 溶液で処理 した後、 卜 ロ ンビンを作用させる こ と によ り ト ロンビンの ト ロンボモジュ リ ンに対する結合における 各モノ ク ローナル抗体の影響を検討 した。
    [0063] すなわち、 実施例 2 ( a ) で調製 したエラスターゼ フ ラグメ ン ト溶液 （ SOOng Z^ ) で、 96ゥエル ミ ク ロタ イ ト レーシ ヨ ンプレー ト （ Flow Lab. In ）を コー ト した後 . 未コー ト部分を 1 % BS A でブロ ッ ク した 。 次に実施例 1 ( i ) で得られた各モノ ク ローナル抗体の濃度が、 0 ， 0.25, 0.5 , 1 , 2 および g / と なる よ う に調製 した リ ン酸緩衝溶液 （ PH 7.5 ) Q ϋ を 、 それぞれ、 コ ー ト したプレー トの各ゥエルに加え、 37。Cで 6 時間反応 させた。 次に、 抗体溶液を除去 し、 プレー 卜 を 、 0. 1 % BSA 含有 ト リ ス 一塩酸緩衝液 （ PH 7.5 ) で 2 回洗浄 した 後、 ト ロ ンビン溶液 （ 500 n g / i ^生理食塩水 ） 50 』 を プレー トの各ゥエルに加え 、 37でで 30分間反応させた。 ト ロ ンビン溶液を除去 し、 0 · 1 % BSA 含有 ト リ ス一塩酸 緩衝液 （ PH 7 · 5 ) で 2 回洗浄 した後、 発色性合成基質を 用いる ト ロ ンビン測定法 （櫻川信男 ， Med ica I Techno- logy, 1_3, 704 - 713 ( 1985 ) ) によ り 、 ト ロ ンビン活 性を測定した。
    [0064] すなわち、 Kab i社製の試薬にょ り調製 した基質一ポ リ プレン溶液 （ S-2238 : 0.8 m M ) を 、 プレー 卜の各ゥエル に 100ス J ずつ加え 、 37てで 5.分間反応させた後、 50% 酢酸溶液 50 J! を加えて反応を停止させた。 反応停止後、 前記マイ ク ロプレー ト リ ーダーを用いて 、 405 ηπιの吸 光度を測定した。 この吸光度は、 プレー トにコー ト され た ト ロンボモジュ リ ンのエラスタ一ゼ フ ラグメ ン トに 結合 した ト ロンビン 量に比例している 。 この測定結果 よ り 、 IgG ( ク ロー ン 21-3H1 ) と IgG ( ク ロー ン 2卜 4G3) は、 トロンビンの ト ロンボモジュ リ ンに対する結合を強 く 阻害する こ と が認め られた （第 3表） 。
    [0065] (a) および（b) の結果から 、 IgG ( ク ローン 21-3H1 ) 、 IgG ( ク ローン 21-4G3) 、 IgG ( ク ローン 21-6F7) およ び IgG ( ク ロー ン 21 -9M'2)は、 t ト ト ロ ンボモジュ リ ン の生理活性に影響を及ぼす抗ヒ ト ト ロ ンボモジユ リ ンモ ノ ク ローナル抗体であ り 、 プロテイ ン C活性化阻害作用 を持つこ と がわかった。 さ らに、 IgG ( ク ロー ン 21-3H1 ) および IgG ( ク ロー ン 21-4G3) は、 強い ト ロ ン ビン結合 阻害作用を持つ こ と がわかっ た 。 ま た、 ト ロ ンボモジ ュ リ ンのエラスターゼ フ ラグメ ン トに対する これらの モ ノ ク 口 — ナ ル 抗体の結合性を、 ィ ムノ ブロ ッテ イ ン グ法を用いて調べた結果、 IgG ( ク ロー ン 2卜 3H1 ) 、 IgG ( ク ロー ン 21-4G3) 、 IgG ( ク ロー ン 21-6F7) およ び IgG ( ク ローン 21-9H12)は、 いずれも 、 このエラスタ ーゼフ ラグメ ン トに対する結合性を持って いる こ と がわ かった。
    [0066] 実施例 3
    [0067] ヒ ト血中 ト ロ ンボモジユ リ ンの定量
    [0068] (a) 酵素標識モノ ク ローナル抗体の調製 (1 ) Fab '.画分の調製
    [0069] 実施例 1 ( i ) で得られた各精製モノ ク ローナル抗体 ( IgG ) を 0. 1 M塩化ナ ト リ ウム含有 0. 1 M酢酸緩衝 液 （ pH 4.2 ) .に溶.解 し、 その溶液を以下述べる よ う .に して ペ プシ ンで消化 した 。 すなわち 、 前記画分中の. IgGに対 して 2 % ( w/w)のべプシンを加え 、 37°C 、 24 時間消化 した 。 さ らにその消化物に、 2 M ト リ ス溶液 を加えて PHを 7.0 に調整.する こ と によ って反応を停止 せ しめ、 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （ f)H 7.0 ) で平衡化 した ウル ト ロゲル A c A 44カ ラムを用いたゲルろ過によ り 、 F (ab ' )2 画分を分取 した。
    [0070] 次に、 この F (ab ' )2 画分を 5mMエチレンジァ ミ ン四 酢酸 （ EDTA ) 含有 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （ pH 6.0 ) 中で 透析 し 、 最終濃度 1 O M と なる よ う にア ミ ノエタ ンチ オール （ を加え 37でで 1.5時間還元 した後、 5ηιΜ 含有 C. 1 M リ ン酸緩衝液 （ pH 6.0 ) で平街化 した 、 ウル ト ロゲル AcA 44カラムを用いて ゲルろ過し、 fab ' 画分を分取 した。
    [0071] (2) マレイ ミ ド標識西洋わさびペルォキシダーゼ（POD ) 画分の調製
    [0072] 上記（ 1 ) の操作と は別に、 以下に述べる よ う に して POD にマレイ ミ ドを標識 した。 すなわち、 POD を 10mg ノ^の濃度で、 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （ 7.0 ) に溶解 し、 その P0D に対 して 、 25倍モル量の N — ( ε —マレ イ ミ ドカプロィ ルォキ シ ） コノ、ク酸イ ミ ド （ ) を ジメチルホルムア ミ ド溶液と して加え、 30°C、 30分間 反応させた。 これを 0.1Mリ ン酸緩衝液 （ pH 6.0) で 平衡化 したセフ アデヅ クス G— 50カラムでゲルろ過し、 マレイ ミ ド標識 POD 画分を分取 した。
    [0073] (3) Fab'-POD複合体画分の調製
    [0074] 前記（1) で調製した画分中の Fab'に対して 、 上記（2) で得られた画分中のマレイ ミ ド標識 POD と して等モル - になる よ う に両画分を混合 し、 さ らに Fab'およびマレ イ ミ ド標識 POD の最終濃度が 100 Mとなる よ う に、 5niM EDTA 含有 0.1Mリ ン酸緩衝液 （ pH 6.0) で希釈 した。 この混合液を 4で、 20時間反応後、 Fab'の 10倍 モル量の N—ェチルマレイ ミ ドで未反応のチオール基 を ブロ ッ ク した。 これを 0.1M リ ン酸緩衝液 （ pH 6.5 ) で平衡化したウル ト ロゲル AC A 44カラムを用いて ゲル ろ過し、 Fab'-POD複合体画分を分取後、 0.1% BSA お よび 0.001 %ク ロルへキシジンを添加 し、 4でで保存 した。
    [0075] (b) 1段階サン ドイ ッチ法によ る ヒ ト血中 ト ロンボモジ ュ リ ンの定量
    [0076] ヒ 卜 ト ロンボモジュ リ ンの生理活性に影響を及ぼす抗 ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ンモノ ク ローナル抗体の う ち、 プ ロティ ン C活性化阻害作用を持つモノ ク ローナル抗体と 、 卜 ロ ンビン結合阻害作用を持つモノク ローナル抗体と の 組み合わせを用いて行った。
    [0077] すなわち、 J. Immunoassay, 4 , 209 - 327 ( 1983 ) に記載の石川 らの方法に従って 、 '実施例 1 ( i ) で得られ た精製モノ ク ローナル抗体を 、 それぞれ 0.1%アジ化ナ ト リ ウム含有 0. 1 M リ ン酸緩衝液 （ pH 5 ) に溶解 して 、 その濃度を 0. 1 m2に調整 した。 この抗体溶液に、 固 相担体と してポ リ スチ レ ンボール （ 径 6.5瞧 ， Pe r c i s i - on P last i c Ba I I )を浸漬 し 、 ポ リ スチレ ンボールに抗体' を コ ー ト した 。 次に、 抗体浸漬液を 回収 し 、 ポリ スチ レンボールを 0. 1 % B S A 、 0. 1 M塩化ナ ト リ ウムおよび 0. 001 % ク ロルへキシジン含有 10mM リ ン酸緩衝液 （ pH 7. 0 ) で洗浄 し、 4 Cにて保存 した。
    [0078] 標識試料と して 、 ヒ 卜 卜 ロ ンボモジュ リ ンモノ ク ロ ーナル抗体 （ ク ローン 21 -4G3 ) 結合セ フ ァ ロース 4Bカラ ム （ 以下、 抗 TM抗体力ラム と い う 〉 によ るァフ ィ 二テ ィ 一ク ロマ ト グラ フ ィ ーを用いて 、 t ト胎盤から精製した ト ロ ンボモジュ リ ンを用いた 。 すなわち、 実施例 1 ( i ) で得られた抗ヒ 卜 ト ロ ンボモ ジュ リ ンモ ノ ク ローナル抗 体 （ ク ロー ン 21 - 4 G 3 ) を 、 C N B Γ活性化セ フ ァ ロース 4 B ( フ アルマシア ） 1 当た り 、. 5 ragの割合で固定化 した。 これをカラム （ 1 X 5 cm ) に充填 し、 抗 TH抗体力ラムを 得た。 一方、 実施例 1 (a) の方法に従って 、 界面活性剤 を用いて ヒ 卜 ト ロンボモ ジュ リ ンを抽出および可溶化 し た後、 この溶液を 0.5% Tr i ton-Xを含む 0. 1 M塩化ナ ト リ ウム含有 20mM ト リ ス ー塩酸緩衝液 （ 7.5) (TBS) で平街化 した抗 TM抗体カラムにかけ、 Tr i ton-X 含有 TBS で、 非結合タ ンパク 質を充分に洗浄除去後、 力 ラムに結合 したヒ ト ト ロ ン ^モジュ リ ンを 8 M尿素溶液 で溶出 した 。 こ の溶出液を集め 、 0 · 01 %ルブロー /レ含 有 TBS で平衡化したウル ト ロゲル AcA 44カラム （ 1.5 X 00 cm ； 168πιϋ ) を用いて ゲルろ過 し、 Α 28。 における 吸光度が高いフ ラ ク シ ョ ンを分取 し、 濃縮して ヒ 卜 ドロ ンボモジュ リ ンを精製した。 この精製ヒ ト ト ロンボモジ ュ リ ンは、 実施例 1 ) に記 した SDS-PAGEで調べたと こ ろ 、 実施例 1 ( a ) で得られた精製 t ト ト ロンボモジユ リ ン と 同様の泳動パターンを示した。 この精製ヒ ト ト ロ ン ポモジュ リ ンを 、 0.1 M塩化ナ ト リ ウムおよび 1 % BS A 含有 10 πι Μ ト リ ス緩衝液 ( H 7.0) を用いて 、 64 ii g Z miの溶液を調製 し 、 これを段階希釈 した溶液を各々 50 ずっ と り 、 標準試料と した。
    [0079] 一方、 検体試料と しては、 健常人血清および膠原病患 者血清を各々 50ズ ϋ 用いた。
    [0080] 上記の試料をそれぞれ試験管にと り 、 （a) で調製した Fab'- POD複合体画分 （ 300〜 1000 n g Z m2 ) 、 1 % BSA 、 0. 1 M塩化ナ ト リ ウムおよび 10i¾M EDTA 含有 3GreM リ ン酸緩衝液 （ PH 7.0.) 300 i に溶解 した。 次にこれら の各々 の試験管に、 前記にて調製したモノ ク ローナル抗 体結合ポ リ スチレ ンボールを 1 個ずつ添加 して 、 室温で 1 時間静置した後、 50 mM塩化ナ ト リ ゥム含有 5raM リ ン 酸緩衝液 （ ΡΗ 7.0) にて洗浄した。 次に、 0.1 Μ酢酸緩 衝液 （ ρΗ 5.5 ) に溶解した POD 基質、 すなわち、 0.025 %テ ト ラメ チルベンチジン （ TMBZ) を 300 J! ずつ加え、 さ らに 0.0075 %過酸化水素水を 300 J! ずつ加え 、 室温 で 30分間靜置 した後、 1.75N硫酸 800 、 β を添加する こ と によ り 反応を停止させた。 島津マイ ク ロ フ ロー紫外可 視分光光度計 （ UV- 730 ) で反応混合液の波長 450 ηπιの吸 光度を測定 し、 標準試料よ り 作成 した検量線よ り 、 検体 試料の吸光度に相当する ヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ン濃度 ( 以下、 ΤΜ濃度と 略す'） を読み取った。
    [0081] ヒ 卜 ト ロ ンボモジュ リ ンの生理活性に影響を及ぼす抗 ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ンモノ ク ローナル抗体である IgG ( ク ロー ン 21 -3H1 ) 、 IgG ( ク ロー ン 2卜 4G3 ) 、 IgG ( ク ローン 21-6F7 ) および IgG ( ク ローン 21-9H12)は、 いずれも本実施例における固相担体と して用いる こ と が できた。 ただ し、 ISG ( ク ロー ン 21-3H1 ) を固相用抗体 と し、 IgG ( ク ロー ン 21-4 G3 ) を標識用抗体と して用い た場合、 および IgG ( ク ローン 21-4G3 ) を固相用抗体と し、 IgG ( ク ローン 21-3H1 ) を標識用抗体と して用いた 場合は、 測定が不可能であった。 IgG ( ク ローン 21-4G3 ) を固相用抗体と し、 IgG ( ク ロー ン 21- 9H 12)を標識用抗 体と して用いて得られた標準曲線を第 1 図に示す。 第 1 . 図に示すよ う に、 ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ン標準試料の濃 度の上昇に伴って 、 A 45。 は増加 し、 定量感度は、 試料 1 当た り 1 n gであった。
    [0082] (c) 膠原病患者における血中 ト ロ ンボモ ジュ リ ン 定量 上記（ b ) において示 した酵素免疫測定法によ り 、 健常 人および 5 種類の膠原病患者における血中 ト ロ ンボモジ ユ リ ンを定量した。 すなわち、 検体試料と して健常人血 清 （ 79検体 ） および膠原病患者血清 （ 54検体） を各々 50 μ Ά ずつ用いて 、 ΤΜ濃度を測定 した。 その結果、 第 4表 の 1 〜 3 にみられる よ う に、 健常人血清中の ΤΜ濃度 （平 均 ± S. D. ) は、 2.96± 0.71 n g Z であった。 一方、 膠 原病患者では、 SLE 患者血清 26検体中、 混合性結合織病 . 患者血清 5検体中、 慢性閬接 リ ウマチ患者血清 9検体中、 . 進行性全身性硬化症患者血清 5検体中およびシ ダレン - 症候群患者血清 9検体中の TM濃度 （平均土 S. D. ) はそれ ぞれ 6.98± 4.55 n g / m2 5.98± 3.53 n g / 、 7.86土 4.95 n g / mi . 6.04± 4.63 n g / ffl2 s 7.57± 6. U n g / i»2であった。 これらの値はいずれ 、 健常人血清中の TM 濃度 （ 2.96 ± 0.71 n g / mi ) に比し有意に高かった。
    [0083] 次に、 膠原病患者の病態経過における TH濃度の変動を 上記（b) において示 した酵素免疫測定法を用いて観察し た結果の一例を第 2 図に示す。 なお、 第 2 図に示された 患者は、 SLE 患者であ り 、 従来よ り この病態の経過観察 に用いられて いる 、 免疫異常を代表する血清中の補体価 (補体第 3成分のペプチ ド断片 ： C3c および補体第 4成 分 ： C4 ) の測定を同時に行った。 第 2図中の （〇） は TM 濃度を 、 （ Δ ) は C3 C 量を 、 また、 （ 口 ） は、 C4量を示 す。 図 2 にみられる よ う に、 患者血清中の TH濃度と患者 血清中の補体価を示す C3 C 量や C4量と の間には、 逆相関 性が認め られた。 こ こに示されたよ う に、 膠原病患者の 治療における病態観察においてほ、 従来よ り用いられて き た免疫異常を示すパラメ 一夕一の他に、 血中 ト ロ ンボ モジュ リ ンを定量する こ と によ って 、 病変の場である血 管の障害の程度を知る こ と ができ 、 治療効果の向上を も た らすこ と が期待でき る 。
    [0084] (d) 腎臓病患者における血中 ト ロンボモジュ リ ンの定量 前記（b) において示 した酵素免疫測定法を用いて 、 4 種類の腎臓病患者における血中 ト ロンボモジュ リ ンを定 量 した。 すなわち、 検体試料 と して腎臟病患者血清 （ 34 検体 ） を各々 50 J ずつ用いて TM濃度を測定 し、 上記（C ) で得られた健常人血清中の TM濃度と比較した。 その結果、 第 4 表の 1 および第 5表に示すよ う に、 健常人血清中の TM濃度 2.96± 0. 71 n g ( 平均 ± 3.0. ) に比 し、 腎臓 病患者にお いて は 、 糖尿病性腎症患者血清 10検体中、 - 膜性腎症患者血清 11検体中 、 ネ フ ローゼ症候群患者血 清 10検体中お よびア ミ ロ イ ド一シ ス患者血清 3検体中 の TM濃度 （ 平均土 S. D. ) は、 それぞれ 7.06土 7. 19 n
    [0085] . 6.37± 2.39 ng / . 9.24± 5.39 n g / . 8.83± 1. 17 n g / ^と 、 有意に高かった。
    [0086] q es
    [0087] 第 1 表
    [0088] 1
    [0089] D C クローン モノクローナル サブクラス 番号 抗体番号
    [0090] 21 -3H1 FTM- -5 IgG I κ
    [0091] 21 -4G3 MFTM- -4 IgG2a/ κ
    [0092] 21-5D2 HFTH- -1 IgG / κ
    [0093] MFTM- -3 IgG 1
    [0094] 21-7E3 MFTM- -2 IgG 1/ κ
    [0095] MFTM- -6 IgG 1ム
    [0096] クロ- -ン番号 . 親和定数 （K d)
    [0097] 21一 3H1 9.6 X 10— 1 β
    [0098] 21 -4G3 3.6 X 10"10
    [0099] 21 -5D2 1.7 X 10 "3
    [0100] 21 -6F7 1.2 X 10 ~3
    [0101] 21 -7E3 2.7 X 10 -l 0
    [0102] 21 -9H12 3.5 X 10 -l0 第 3 表
    [0103] クローン プロテイン C 卜ロンビン 番号 活性化阻害作用 結合阻害作用 1—3111 十 十 1-4G3 十 + 1 -5D2
    [0104] 1-6F7 +
    [0105] 1-7E3
    [0106] 1-9H12 +
    [0107] 第 4表の 1 健常人血清 検体 TM 檢休 检
    [0108] .¾ ΐΗ：¾ 'J- ί V n 1 l i / / f 1 π11 I ) ¾Γ 'J f n /iir 1 ) ¾-& ig/ni丄ノ
    [0109] 1 2.9 31 3.0
    [0110] 2 4.6 32 4 9 ^
    [0111] 3 3.3 33 3.9 63
    [0112] 4 3.2 34 2.9 ¾ q
    [0113] 5 2.2 35 2.1 65
    [0114] 6 2.4 36 2.2 66 1 9
    [0115] 7 3.8 37 2.9 67 3 9
    [0116] 8 2.2 38 2.8 68 2 6
    [0117] 9 2.5 39 2.9 69 2.4
    [0118] 10 3.4 40 3.3 70 2.7
    [0119] 11 3.5 41 1.9 71 2.8
    [0120] 12 3.5 42 2.3 72 2.6
    [0121] 13 3.2 43 2.7 73 1.7
    [0122] 14 2.3 44 2.8 74 3.3
    [0123] 15 3.3 45 2.4 75 3.3
    [0124] 16 4.1 46 2.4 76 4.3
    [0125] 17 3.4 47 2.6 77 2.8
    [0126] 18 4.8 48 2.6 78 2.2
    [0127] 19 3.1 49 3.7 79 3.0
    [0128] 20 2.0 50 3.4
    [0129] 21 2.8 51 - 2.7
    [0130] 22 2.9 52 2.2
    [0131] 23 3.4 53 2.2
    [0132] 24 2.7 54 2.5
    [0133] 25 2.4 55 2.3
    [0134] 26 2.5 56 2.7
    [0135] 27 3.2 57 4.4
    [0136] 28 2.9 58 2.0
    [0137] 29 3.6 59 2.6
    [0138] 30 3.6 60 2.5. 平均土 S. D . 2 . 9 6 ± 0 . 7 1 ng/ml
    [0139] 第 4表の 2
    [0140] S L E 混合性 慢性関節
    [0141] 結合織病 リゥマチ 検体 検体 TM濃度 検体 TM濃度 検体
    [0142] 番号 (ng/ml) 番号 (ng/ml) 番号 (ng/ml) 番号 (ng/ml)
    [0143] 1 3.2 14 3.5 1 3.2 1 7.6 '
    [0144] 2 2.0 15 7.9 2 4.1 2 4.8
    [0145] 3 4.2 16 2.9 3 11.5 3 10.7
    [0146] 4 6.3 17 2.9 4 7.5 4 5.9
    [0147] 5 2.1 18 18.0 5 3.6 5 14.5
    [0148] 6 4. 1 19 3.3 6 1.7
    [0149] 7 3.2 20 2.6 7 8.3
    [0150] 8 7. 1 21 13.4 8 15.2
    [0151] 9 14.0 22 12.9 9 2.0
    [0152] 10 8.8 23 8.2
    [0153] 11 5.5 24 15.2
    [0154] 12 6.0 25 11.4
    [0155] 13 7.3 26 5.5 平均 6.98 平均 5.98 平均 7.86 土 S.D. ±4.55 土 S. D. 土 3.53 土 S.D. ±4.90 第 4表の 3 進行性全身性 シエグレン症候群 仆 検体 TH 濃度 検体 TM濃度 ng/ral) 番号 、ng/ml)
    [0156] W
    [0157] 1 4.5 1 10.2
    [0158] 2 14.2 2 5.6
    [0159] 3 5.0. 3 8.8
    [0160] 4 3.6 4 5.2
    [0161] 5 2.9 5 4.9
    [0162] 6 22.5
    [0163] 7 2.6
    [0164] 8 5.8
    [0165] 9 ' 2.5 平均 平均
    [0166] 土 S. D. 6.04±4.63 土 S. D. 7.57±6.14
    [0167] - 3
    [0168] 第 5表 ' [ 図面の簡単な説明 ] .
    [0169] o 5
    [0170] 第 1 図は、 実施例 3 ( b ) で得られた標準曲線、 すなわ ち 、 I9G ( ク ロー ン 2卜 4G3 ) を固相用抗体 と し、 IgG ( クローン 21- 9H 12)を標識用抗体と して用いた 1 段階サ 5 ン ドィ ツチ法における 、 ヒ ト ト ロ ンボモジュ リ ンの標準 曲線を示す図であ り 、 第 2 図は、 実施例 3 ( c ) で得られ た膠原病患者の病態経過における血清中の TM濃度および 補体価の変動の一例を示す図である 。 0
    [0171] 5
    权利要求:
    Claims 請 求 の ' 範' 囲
    ( 1 ) ト ロンビンによ る プロテイ ン Cの活性化を促進する 卜 ロ ンボモジュ リ ンの作用を阻害する作用を持つ抗ヒ ト ト ロンボモジュ リ ンモ ノ ク ローナル抗体。
    ( 2 ) 上記のモノ ク ローナル抗体が、 ト ロンビンの ト ロン ボモ ジュ リ ンに対する結合を阻害する作用を持つ もの. である請求項（ υ に記載の抗ヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ン モノ ク ローナル抗体。
    ( 3 ) ト ロンビンによ るプロテイ ン Cの活性化を促進する ト ロ ンボモジュ リ ンの作用を阻害する作用を持つ抗ヒ ト ト ロ ンボモ ジユ リ ンモ ノ ク ローナル抗体を用いて 、 酵素免疫測定を行 う こ と によ り 、 血中に存在する ヒ ト ト ロンボモジュ リ ンおよびその分解産物の う ち、 前記 のモノ ク ローナル抗体と 結合する物質を定量 し、 その 定量値を 、 健常人血中の定量値と 比較する こ と に基づ いて 、 血管内皮障害を診断する方法。
    ( 4 ) 前記のモノ ク ローナル抗体と して 、 二種類のモ ノ ク ローナル抗体を使用 し、 その一種類が、 ト ロンビンの ト ロンボモジュ リ ンに対する結合を阻害する作用を持 つ抗ヒ ト ト ロンボモジユ リ ン.モノ ク ローナル抗体であ り 、 他の一種類が、 ト ロ ンビンの ト ロ ンボモ ジュ リ ン に対する結合を阻害する作用は持たないが、 卜 ロ ンビ ンによ る プロティ ン C话性化を促進する ト ロ ンボモジ ュ リ ンの作用を阻害する作甩を持つ抗ヒ ト ト ロ ンボモ ジュ リ ンモノ ク ローナル抗体である請求項（3 ) に記載 の血管内皮障害を診断する方法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    JPH03198793A|1991-08-29|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-07-11| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1991-07-11| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): DE FR GB IT |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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